Od chvíle, ako sa Peter Parker (TOBEY MAGUIRE) rozhodol opustiť svoju dlhoročnú lásku Mary Jane Watsonovú (KIRSTEN DUNSTOVÁ), aby sa mohol v kostýme Spider-Mana aj naďalej zodpovedne venovať svojmu povolaniu superhrdinu, uplynuli dva roky. Jeho túžba po milovanej M.J. však postupom času len vzrastá a preto sa teraz pohráva s myšlienkou, že by sa tajného života superhrdinu na dôkaz svojej lásky zriekol. No M.J. sa medzitým rozhodla ísť svojou cestou – vydala sa na dráhu filmovej herečky a v jej živote figuruje nový muž. Peter má problémy aj so svojím najlepším priateľom Harrym Osbornom (JAMES FRANCO). Ich kamarátsky vzťah čoraz väčšmi zatieňuje Harryho nenávisť voči Spider-Manovi, ktorého obviňuje zo smrti svojho otca. Keď sa už zdá, že to už horšie ani nemôže byť, ocitne sa Peter tvárou v tvár mocnému Dr. Octopusovi (ALFRED MOLINA) – diabolskému netvorovi s dvoma pármi smrtiacich chápadiel, ktorý mu je viac než dôstojným protivníkom. Aby sa mu podarilo jeho vyčíňanie zastaviť, musí sa naučiť žiť so svojím osudom a využiť všetky svoje schopnosti, ktoré sú mu darom i kliatbou zároveň.